**印跡在實驗的過程中常出現的問題

 **印跡在實驗過程中常出現的問題：

        1. Western blot結果中的背景為什么較高? 

        可能的原因及建議 
        1.膜封閉不夠——延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。 
        2.一抗稀釋度不適宜——對抗體進行滴度測試，選擇*適宜的抗體稀釋度。 
        3.一抗孵育的溫度偏高——建議4℃結合過夜。 
        4.膜在實驗過程中干過——實驗過程中要注意保持膜的濕潤。 

        5.檢測時曝光時間過長——減少曝光時間。 

        2. Western blot結果中雜帶較多 

        可能的原因及建議 

        1.目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。 
        2.目的蛋白有其它剪切本——查閱文獻或生物信息學分析可能性。 
        3.樣本處理過程中目的蛋白發生降解——加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。 
        4.上樣量過高，太敏感——適當減少上樣量。 
        5.一抗特異性不高——重新選擇或制備高特異性的抗體。 
        6.一抗不純——純化抗體 

        7.一抗或者二抗濃度偏高——降低抗體濃度。

        3. Western blot結果中無信號或顯示信號弱 
        可能的原因及建議 
        1.檢測樣本不表達目的蛋白——選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。 
        2.檢測樣本低表達目的蛋白——提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。 
        3.轉移不完全或過轉移——可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。 
        4.抗體不能識別測試種屬的相關蛋白——購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。 
        5.一抗孵育時間不足——建議4℃結合過夜。 
        6.二抗與一抗不匹配——選擇針對一抗來源的種屬的抗體。 
        7.洗膜過度——洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。 

        4. 其它現象： 
        1.膜上多處出現黑點或黑斑——抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。 
        2.反白（條帶顯白色）——目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。 

        3.蛋白分子量偏低或偏高——膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。 

        5. TBS與PBS的區別 
       PBS的緩沖能力強于TBS（因為混合緩沖液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩沖液優選TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液則優選PBS。 

       Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據需要選擇合適的濃度。 

        6. Western是否可以同時加兩種或者多種一抗 

       通常情況下只加一種種一抗。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。 

       7. PVDF與NC膜的區別 
       PVDF膜價格較貴，可重復使用，結合能力較強，但價格較昂貴。 

       NC膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性較PVDF膜差，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 

       8. Western一抗的選用 

       理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。 

        9. Western抗體和ELISA抗體的區別 
        一般來說用于western的抗體主要識別氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。 

 做**印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。

       10. “短路”現象的產生和處理 

       如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， *后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。 

       11. Western Blot的染色
       1.陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。 
       2.膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩定。 
       3.生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。 
 
      12. 大分子量蛋白轉移效率低的解決方法 

      可以在轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇能增加蛋白質和NC膜的結合能力，同時可以延長高分子量蛋白質轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；選用上等的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。 

       13. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理 

       DAB顯色在辣根過氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產物，該產物難溶于醇和其他有機溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結合而產生有色的、不溶性偶氮染料。 

       14. 酶顯色與熒光顯色的優缺點 
        **酶技術就是用酶標記已知抗體(或抗原)，然后與組織標本在一定條件下反應并結合，結合形成的復合物中所含有的酶分子遇到底物時，會催化底物水解、氧化或還原，從而發生顯色反應。**酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術，前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上，形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的**反應，稱為非標記抗體酶技術。 
       **熒光技術中的熒光抗體染色標本不能長期保存，對組織細胞的細微結構分辨不清，但**酶技術則能克服上述不足，標記**酶技術的敏感性更優于**熒光法。酶顯色產物具有較高的電子密度，經過適當處理還可以進行**電鏡觀察。